Активация ферментов путем фосфорилирования

Активация ферментов путем фосфорилирования


Глава 2. Ферменты

8 5

240 мкмоль/мин

: 12glO4 мин

0,002 мкмоль

Молярная активность указывает, сколько молекул субстрата превращается од­ ной молекулой фермента за I минуту (молярную активность иногда обозначают как «число оборотов»), В табл. 2.5 приведена молярная активность некоторых ферментов.

Таблица 2.5. Молярная активность некоторых ферментов

Ф ермент

Л кги вн осгь.

Ф ермент

А к iHBHocib,

ч и н

 

мин 1

 

 

Карбоангидраза С

36 000 000

(3-Галактозидаза

12 500

Л5-3-кетостероидизомераза

17 100 000

Фосфоглюкомутаза

I 240

Супероксиддисмутаза

4 800 000

Cyкцинатдегидрогеназа

I 150

Каталаза

I 200 000

Бифункциональный

6

(3-Амилаза

I 100 000

фермент

 

Фумараза

120 000

 

 

Так называемый бифункциональный фермент имеет наиболее низкую моляр­ ную активность среди известных. Однако это не означает, что его физиологичес­ кая роль тоже низка (подробнее об этом ферменте см. рис. 9.31).

Зависимость скорости реакции от температуры. Скорость ферментативных ре­ акций, как и всяких других, зависит от температуры: при повышении температу­ ры на каждые 10 0C скорость увеличивается примерно вдвое (правило Вант-Гоф­ фа). Однако для ферментативных реакций это правило справедливо лишь в обла­ сти низких температур — до 50-60 °С. При более высоких температурах ускоряется денатурация фермента, что означает уменьшение его количества; со­ ответственно снижается и скорость реакции (рис. 2.17, г). При 80-90 0C большин­ ство ферментов денатурируется практически мгновенно. Количественное опреде­ ление ферментов рекомендуется проводить при 25 °С.

Зависимость скорости реакции от pH. Изменение pH приводит к измене­ нию степени ионизации ионогенных групп в активном центре, а это влияет на сродство субстрата к активному центру и на каталитический механизм. Кроме того, изменение ионизации белка (не только в области активного центра) вызы­ вает конформационные изменения молекулы фермента. Колоколообразная фор­ ма кривой (рис. 2.17, д) означает, что существует некоторое оптимальное состоя­ ние ионизации фермента, обеспечивающее наилучшее соединение с субстратом и катализ реакции. Оптимум pH для большинства ферментов лежит в пределах от 6 до 8. Однако есть и исключения: например, пепсин наиболее активен при pH 2. Количественное определение ферментов проводят при оптимальном для данно­ го фермента pH.

Зависимость скорости реакции от времени. По мере увеличения времени инкубации скорость реакции снижается (рис. 2.17, е). Это может происходить

86

Часть I. Строение информационных молекул и матричные биосинтезы

вследствие уменьшения концентрации субстрата, увеличения скорости обратной реакции (в результате накопления продукта прямой реакции), ингибирования фермента продуктом реакции, денатурации фермента. При количественном оп­ ределении ферментов и кинетических исследованиях измеряют начальную ско­ рость реакции (скорость непосредственно после начала реакции). Время, в тече­ ние которого скорость с допустимым приближением можно считать начальной, для каждого фермента и для данных условий подбирается экспериментально, на основе графика, представленного на рис. 2.17, е. прямолинейный участок графи­ ка, начинающийся от отметки нулевого времени, соответствует интервалу време­ ни, в течение которого скорость реакции равна начальной скорости или близка к ней (на рисунке этот интервал отмечен пунктирной линией).

ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ

Ингибиторами ферментов называют вещества, снижающие их активность. Наи­ больший интерес представляют ингибиторы, взаимодействующие с активным центром фермента. Такие ингибиторы чаще всего являются структурными анало­ гами субстрата и, следовательно, комплементарны активному центру фермента. Поэтому они подавляют активность только одного фермента или группы фермен­ тов с очень сходным устройством активного центра. Различают ингибиторы кон­ курентные и неконкурентные, обратимые и необратимые.

Малоновая кислота HOO C —CH2—COOH является структурным аналогом ян­ тарной кислоты, поэтому она может присоединяться к активному центру сукцинатдегидрогеназы (см. выше). Ho дегидрирование малоновой кислоты невозмож­ но. Если в реакционной смеси имеются одновременно и янтарная, и малоновая кислоты, то происходят следующие процессы:

E + S J ± E S « 2 E + P

E + I EI

Некоторые молекулы фермента оказываются занятыми ингибитором (I) и не участвуют в реакции превращения субстрата: следовательно, скорость образования продукта снижается. Если повышать концентрацию субстрата, то доля комплекса ES увеличивается, а комплекса EI уменьшается: субстрат и ингибитор конкурируют за активный центр фермента. Это пример конкурентного ингибирования. При до­ статочно высокой концентрации субстрата весь фермент будет в форме комплекса ES и скорость реакции будет максимальной, несмотря на присутствие ингибитора.

Некоторые ингибиторы образуют комплекс не со свободным ферментом, а с фермент-субстратным комплексом:

ES + I ESI

Вэтом случае повышение концентрации субстрата не уменьшает действие ин­ гибитора; такие ингибиторы называются неконкурентными.

Внекоторых случаях ингибитор может подвергаться химическому превраще­ нию под действием фермента. Например, n-нитрофенилацетат гидролизуется протеолитическим ферментом химотрипсином; гидролиз происходит в две ста­ дии (рис. 2.18).

Глава 2. Ферменты

87

a O2N-

 

О

о

E— О— С— CH, + Н,О —► E— ОН+HO— С— CH3+H0O

I

I

О

о

Рис. 2.18. Гидролиз л-нитрофенилацетата химотрипсином

Сначала ацетильный остаток присоединяется к гидроксильной группе остатка серина в активном центре фермента (реакция а), а затем происходит гидролиз ацетил-фермента (реакция б). Первая стадия протекает быстро, а вторая — очень медленно, поэтому даже при небольших концентрациях и-нитрофенилацетата значительная часть молекул фермента находится в ацетилированной форме, и скорость гидролиза природного субстрата (пептидов) снижается. Такие ингиби­ торы называют псевдосубстратами или плохими субстратами.

Иногда химическое превращение ингибитора в активном центре приводит к образованию промежуточного продукта, очень прочно, необратимо связанного с ферментом: такое явление называют суицидным катализом. Например, 3-хлора- цетолфосфат необратимо ингибирует триозофосфатизомеразу. Этот ингибитор является структурным аналогом диоксиацетонфосфата: он дехлорируется и нео­ братимо присоединяется к остатку глутаминовой кислоты в активном центре фер­

мента (рис. 2.19).

 

 

 

 

О

 

 

1\

он

 

CH2-Cl

CH

2I

+

C = O

CR2

 

CH2— O P O 3H2

-NH— CH— CO-

 

с /

сн

 

 

 

V———

 

 

 

I

I

2

 

->

CTh 2

c^

0

+ H C l+ H2O

 

CH2

CH2— OPO3H2

 

— NH— CH— CO

Рис. 2.19. Необратимое ингибирование триозофосфатизомеразы

Ингибиторами могут быть не только аналоги субстратов, но и аналоги коферментов, способные занимать место настоящего кофермента, но не способные выполнять его функцию.

Взаимодействие фермента с ингибитором часто в такой же мере специфич­ но, как и взаимодействие с субстратом или коферментом. На этом основано

88

Часть I. Строение информационных молекул и матричные биосинтезы

применение ингибиторов для избирательного подавления активности того или иного фермента в сложной ферментной системе или в организме. В частности, многие лекарственные вещества являются ингибиторами определенных ф ер­ ментов.

Есть ингибиторы, действующие менее избирательно. Например, и-хлормерку- рибензоат является специфическим реагентом на сульфгидрильные группы в бел­ ках (рис. 2.20). Поэтому и-хлормеркурибензоат ингибирует все ферменты, кото­ рые имеют SH-группы, участвующие в катализе.

Cys— SH+ Cl— Hg—

— COOH ™ Cys— S— Hg— ( ^ j>— COOH

Рис. 2.20. Реакция л-хлормеркурибензоата с сульфгидрильными группами белков

Другим примером может служить ингибирование диизопропилфторфосфатом пептидгидролаз и эстераз, имеющих серин в активном центре. Ингибитор необра­ тимо присоединяется к остатку серина (рис. 2.21).

H3C — C H — CH,

 

H1C — C H — CH1

I

 

 

I

 

T

I

-HF

?

I

O = P — F

+HO— Ser

—►

O = P — О— Ser

H3C — C H — C H 3

 

H3C — C H — CH3

Рис. 2.21. Ингибирование диизопропилфторфосфатом сериновых ферментов

Остатки серина вне активного центра при этом остаются незатронутыми; сле­ довательно, фермент сам катализирует реакцию, которая губит его. Диизопропилфторфосфат — представитель группы фосфорорганических соединений, об­ ладающих чрезвычайно высокой токсичностью. Токсическое действие обусловле­ но именно ингибированием ферментов, и прежде всего ацетилхолинэстеразы (см. гл. 22).

Пенициллин, одно из самых известных и распространенных лекарств, приме­ няется для лечения ряда инфекционных заболеваний. Пенициллин необратимо ингибирует фермент бактерий гликопептид-трансферазу. Этот фермент участву­ ет в синтезе бактериальной стенки, и поэтому в присутствии пенициллина размно­ жение бактерий невозможно. Гликопептид-трансфераза содержит остаток сери­ на в активном центре (сериновая пептидгидролаза). В молекуле пенициллина есть амидная связь, по свойствам сходная с пептидной связью (рис. 2.22). В результате разрыва этой связи, катализируемого ферментом, остаток пенициллина оказыва­ ется необратимо связанным с ферментом.

Ингибиторы — очень эффективные инструменты для исследования строения активного центра ферментов и механизма катализа. Ингибиторы, необратимо



Источник: studfile.net


Добавить комментарий