Коллагеновые матрицы

Коллагеновые матрицы

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и касается способа получения биорассасываемой матрицы, состоящей из нативного не реконструированного коллагена I типа, самой биорассасываемой матрицы, используемой для заполнения дефектов мягких и твердых тканей, в качестве имплантата, а также способа лечения, репарации или замещения ткани с использованием предложенной биорассасываемой матрицы. Способ получения биорассасываемой матрицы включает стадии обработки кожи животного водой; дермы животного водно-щелочным раствором, содержащим гидроксид натрия, калий дигидрофосфат и водный или безводный тетраборнокислый натрий, при температуре от 1 до 10°С; дермы животного водным раствором сульфата натрия и гидроксида натрия; дермы животного водным раствором сульфата натрия; дермы животного водным раствором борной кислоты; при этом обработку дермы животного на третьей, четвертой и пятой стадиях осуществляют при периодическом взбалтывании раствора и периодическом охлаждении до температуры от 1 до 10°С и после каждой из стадий со второй по пятую осуществляют промывку дермы водой до достижения нейтрального значения рН промывных вод. Изобретение обеспечивает создание биорассасываемой коллагеновой матрицы, состоящей из нативного не реконструированного коллагена I типа, которая имеет структуру коллагеновых волокон, идентичную природной коллагенсодержащей ткани, обладает значительными прочностными свойствами и может служить в качестве матрицы для роста, направленной регенерации, улучшения трофики и структуры мягких и твердых тканей. 4 н. и 28 з.п. ф-лы, 3 ил. биорассасываемая коллагеновая матрица, способ ее получения и   применение, патент № 2353397

Рисунки к патенту РФ 2353397

биорассасываемая коллагеновая матрица, способ ее получения и   применение, патент № 2353397 биорассасываемая коллагеновая матрица, способ ее получения и   применение, патент № 2353397 биорассасываемая коллагеновая матрица, способ ее получения и   применение, патент № 2353397

Область изобретения

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, точнее к созданию биорассасываемой коллагеновой матрицы для заполнения дефектов мягких и твердых тканей, которая может найти применение самостоятельно или в комбинации с различными лекарственными или биологически активными веществами в качестве биологического имплантата, для роста, регенерации, улучшения трофики и структуры мягких и твердых тканей, к способу ее получения, а также к способу лечения, репарации или замещения ткани с использованием указанной биорассасываемой коллагеновой матрицы.

Предпосылки изобретения

Биологический имплантат — это медицинское устройство, предназначенное для взаимодействия с биологическими системами с целью лечения, репарации или замещения любой ткани, органа или функции поврежденного или патологически измененного органа. Для замещения утраченных, поврежденных, патологически измененных органов и систем до последнего времени широко использовались искусственные материалы, а также пересадка ауто- и ксенотканей. Практиковалась также пересадка тканей от доноров. Однако в связи с распространением ВИЧ-инфекции и некоторых других видов заболеваний такой путь стал проблематичным. Все большее распространение получают методы, основывающиеся на использовании биологических материалов, способных замещать пораженные участки тканей, их фрагменты или даже целые отдельные части органа.

Среди биологических имплантатов наиболее перспективным считается фибриллярный белок соединительной ткани, а именно коллаген.

Коллаген — белок, находящийся в коже, связках, сухожилиях, кости, хряще и другой соединительной ткани. Коллаген — наиболее распространенный белок в организме животных. Он составляет 25% от общего количества белка. Коллаген образует нерастворимые нити (фибриллы), которые входят в состав межклеточного матрикса соединительных тканей. Коллаген играет важнейшую роль в структурной функции соединительных тканей, обеспечивая их прочность и эластичность. Биосинтез коллагена и последующее образование фибрилл и волокон соединительной ткани — сложный, многоступенчатый и относительно медленный процесс (поэтому столь медленно заживают травмы соединительных тканей, особенно у взрослых). Нарушение отдельных стадий этого процесса приводит к синтезу атипичного, легко разрушающегося коллагена. Синтез нового коллагена — неотъемлемая часть процесса регенерации и нарушение синтеза коллагена ведет к нарушению заживления ран и повышенной ломкости капилляров.

Из литературы также известно, что коллаген частично меняет свою конформацию и свои уникальные свойства при низких (ниже 5) и высоких (выше 10) значениях рН. Поэтому в большинстве случаев исследователи получают не природный коллаген, который особенно ценен в силу своих физико-химических свойств, позволяющих использовать его в различных областях промышленности, а его высокомолекулярные фракции (Jesperson L., Tompson P. Eur. 1992. Eur. 14254. Composting compact Quel Assur. Criter., р.197-203).

В настоящее время хорошо известны многочисленные способы получения коллагена из различных сырьевых источников (Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. «Биологически активные соединения из природных объектов. Свойства, структурно-функциональные взаимосвязи». М.: МГУЛ, 2003, стр.369-412). Однако приведенные методы дают возможность получения не самого коллагена, а его фракций, которые, в лучшем случае, приближаются по своим свойствам к предшественнику коллагена, на основе которого он строит свои цепи, — тропоколлагену.

Известен способ получения коллагена, в котором сырье, содержащее коллаген, предлагается вначале замачивать в воде, охлаждаемой льдом при рН 5,5, а затем, увеличив рН до 10,5, обрабатывать полученный конгломерат алкалазой и затем вновь снижать рН раствора до 5,5. Фильтрация и последующая стерилизация раствора обеспечивают получение коллагена (патент РФ № 2094999, 1997 г.).

Недостатком данного способа является применение в качестве протеолитического фермента щелочной алкалазы при значении рН выше 10, что, как известно из приведенных источников, может привести к частичному гидролизу связей коллагена между оксилизином и глутаминовой кислотой, разрушению основных аминокислот и частичному дегликозированию белковой молекулы, в результате чего нарушается структура коллагена и, следовательно, его ценные физико-химические свойства.

Нативный коллаген, т.е. коллаген с неповрежденной тройной спиралью, в физиологических условиях — при ионной силе 0,15 М хлористого натрия (NaCl), рН 7-7,5 и температуре 37°С дает гели, являющиеся по структуре аналогом соединительной ткани. Все типы клеток при включении в такие гели или нанесении на их поверхность живут и размножаются.

Нативный коллаген получают экстракцией коллагенсодержащих тканей, главным образом кожи или сухожилий, кислыми растворами или путем их обработки ферментами, чаще всего пепсином. При этом ферментативная обработка удаляет неспиральные участки молекулы, обеспечивающие в гелях межмолекулярную сшивку, и прочность гелей значительно понижается. Полученный без ферментативной обработки коллаген дает более прочные гели, что позволяет снизить его концентрацию, но требует очень тщательной очистки, т.к. сам коллаген является очень слабым иммуногеном, и по большей части его иммуногенность объясняется наличием примесей (Chvapil M., van Wrinkle W., Internal. Rev. Connect. Tis. Res., v. 6, р. 1-60, 1973). Очистку коллагена производят обычно путем осаждения, чаще всего хлористым натрием, из кислого или нейтрального раствора; возможна также очистка осаждением при диализе против щелочного раствора, обычно 0,02 М двузамещенного фосфата натрия (Na 2НРО4).

Известно использование коллагена в качестве универсальной основы для трансплантации, например коллагенсодержащий матрикс, выделенный из ткани подслизистой оболочки, который может использоваться как ростовой протез (WO 98/22158, 1999).

Известен универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации, представляющий собой упругоэластичную массу, полученную из двух источников коллагена, где один источник является тканью позвоночного животного одного класса, а второй — животного другого класса, полученный приготовлением раствора коллагена млекопитающего и денатурированного раствора коллагена птицы с использованием уксусной кислоты с последующим биорассасываемая коллагеновая матрица, способ ее получения и   применение, патент № 2353397 -облучением, промывкой водой и фосфатным буфером (RU 2249462 С1, 10.04.2005, A61K 38/39).

Известен также способный к рассасыванию внеклеточный матрикс, содержащий коллаген I и II типа, полученный путем реконструирования и последующего восстановления коллагенового материала путем сшивки химическим агентом, например хиндроитин-4-сульфатом, альдегидом и др. (RU 2002130845 А, 2004).

Известен также коллагенсодержащий продукт медицинского назначения и способ его получения путем обработки промытой водой отмоченной шкуры оленя без остатков мяса, жира, подкожной клетчатки раствором гидроксида натрия, измельчения полученного голья и экстрагирования раствором уксусной кислоты (RU 2240818, 2004).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является материал животного происхождения для хирургических целей, полученный путем многократного промывания кожи животного водой, последующего ее замораживания, разрезания на куски и выделения из них дермы обычными способами, обработки полученной таким образом дермы 10% водным раствором гидроксида натрия, содержащим тетраборат натрия и гидрофосфат калия, на холоду, промывки продукта водой, смесью спирта и хлороформа для удаления воды, раствором, содержащим гидроксид натрия и дигидрофосфат калия, затем сульфатом натрия и борной кислотой с последующим дублением или сшивкой с помощью формальдегида (Европейский патент ЕР 561119 А1, 25.01.1993). Однако данный вид обработки делает материал цитотоксичным и опасным для применения в клинике.

Во всех известных способах получения коллагена и соответственно биорассасываемой матрицы на его основе, включающих гидролиз с протеолитическим ферментом (WO 81/032261, 1981), щелочно-солевую (RU 2031597, 27.03.1995) или кислотную обработку сырья с последующим восстановлением структуры дублением, например альдегидом (США 5106949, 21.04.1992, A61K 35/32), происходит нарушение пространственной структуры и последовательностей продукта, в котором ход расположения коллагеновых волокон имеет неупорядоченную структуру, что приводит к получению реконструированного коллагена.

Полученные таким образом имплантаты представляют собой, в основном, реконструированный коллаген, который, не обладая высокими прочностными свойствами, быстро рассасывается в организме и, следовательно, не может служить в качестве матрицы для регенерации тканей.

Задачей настоящего изобретения является создание биорассасываемой коллагеновой матрицы, состоящей из нативного не реконструированного коллагена I типа, которая имела бы структуру коллагеновых волокон, идентичную природной коллагенсодержащей ткани, обладала бы значительными прочностными свойствами и могла бы служить в качестве матрицы для роста, направленной регенерации, улучшения трофики и структуры мягких и твердых тканей, и разработка способа ее получения.

Описание изобретения

Поставленная задача решена разработкой способа получения биорассасываемой матрицы, состоящей из нативного не реконструированного коллагена I типа, включающего следующие стадии:

— обработку кожи животного, очищенной от волосяных луковиц и подкожно-жировой клетчатки, водой;

— обработку дермы животного водно-щелочным раствором, содержащим гидроксид натрия, калий дигидрофосфат и водный или безводный тетраборнокислый натрий, при температуре от 1 до 10°С;

— обработку дермы животного водным раствором сульфата натрия и гидроксида натрия;

— обработку дермы животного водным раствором сульфата натрия;

— обработку дермы животного водным раствором борной кислоты;

причем обработку дермы животного на третьей, четвертой и пятой стадиях осуществляют при периодическом взбалтывании раствора и периодическом охлаждении до температуры от 1 до 10°С и после каждой из стадий со второй по пятую осуществляют промывку дермы водой до достижения нейтрального значения рН промывных вод.

В одном из вариантов осуществления способа настоящего изобретения дерму животного после первой стадии дополнительно выдерживают при температуре от 1 до 10°С, предпочтительно от 3 до 5°С.

Предпочтительно вторую стадию способа настоящего изобретения осуществляют в течение 5 суток при температуре 3-5°С и замене раствора, по крайней мере, 2 раза в день.

В предпочтительном варианте способа настоящего изобретения на второй стадии в течение суток непрерывное взбалтывание раствора осуществляют 12-16 часов и оставляют раствор в состоянии покоя в течение 8-12 часов.

В следующем варианте способа настоящего изобретения на второй стадии в первые сутки замену раствора осуществляют через каждый час в течение 12-16 часов, а в течение вторых, третьих, четвертых и пятых суток раствор заменяют дважды в сутки.

Предпочтительно вторую стадию способа настоящего изобретения осуществляют при значении рН, равном 7,5-9,5, преимущественно — 8,7.

В следующем варианте осуществления способа настоящего изобретения третью стадию проводят в течение двух суток.

В дополнительном варианте осуществления предлагаемого способа изобретения третью стадию проводят при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 12-16 часов и при охлаждении до температуры от 1 до 10°С в течение, по крайней мере, 8-12 часов.

Предпочтительно третью стадию осуществляют при взбалтывании раствора, по крайней мере, в течение 3 часов при комнатной температуре и сохранении в состоянии покоя, по крайней мере, в течение 8-12 часов при температуре от 1 до 10°С.

В одном из вариантов настоящего способа третью стадию осуществляют при взбалтывании раствора в течение 30 минут каждые два часа при комнатной температуре, по крайней мере, 12-16 часов в течение одних суток.

Предпочтительно охлаждение на третьей стадии осуществляют до температуры от 3 до 5°С.

В еще одном предпочтительном варианте предлагаемого способа на третьей стадии раствор заменяют, по крайней мере, 2 раза в сутки.

Четвертую стадию способа настоящего изобретения предпочтительно осуществляют в течение, по крайней мере, одних суток.

Предпочтительно четвертую стадию осуществляют при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 12-16 часов и при охлаждении до температуры от 1 до 10°С в течение, по крайней мере, 8-12 часов.

В еще одном варианте способа настоящего изобретения охлаждение на четвертой стадии осуществляют до температуры 3-5 оС.

Четвертую стадию предлагаемого способа предпочтительно осуществляют в течение одних суток при взбалтывании раствора в течение, по крайней мере, одного часа не более четырех раз в течение 12-16 часов.

В одном из вариантов осуществления способа настоящего изобретения на четвертой стадии замену раствора в течение одних суток проводят не более четырех раз в день.

Предпочтительно пятую стадию способа осуществляют в течение, по крайней мере, одних суток.

В одном из вариантов осуществления способа настоящего изобретения пятую стадию проводят при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 12-16 часов и при охлаждении до температуры от 1 до 10°С в течение, по крайней мере, 8-12 часов.

В другом варианте осуществления способа настоящего изобретения охлаждение на пятой стадии проводят до температуры 3-5°С.

В следующем варианте осуществления способа настоящего изобретения пятую стадию проводят при взбалтывании раствора в течение одного часа каждые два часа, но не более двух раз в течение, по крайней мере, 12-16 часов.

Предпочтительно после проведения пятой стадии раствор выдерживают в состоянии покоя при температуре от 1 до 10°С в течение, по крайней мере, 8-12 часов.

В одном из вариантов осуществления предлагаемого способа дополнительно проводят сушку полученного продукта до 50-75% влажности, предпочтительно до 65 % влажности.

В еще одном варианте осуществления способа настоящего изобретения дополнительно проводят стадию стерилизации полученного продукта.

Способ настоящего изобретения, включающий описанную комбинацию стадий, осуществляемых в указанной последовательности и при указанных условиях, позволяет сохранять структуру коллагена в ходе его выделения нативной, что дает возможность избегать последующих стадий восстановления структуры реконструированного белка дублением, характерных для известных способов получения коллагеновой матрицы. Таким образом, второй аспект настоящего изобретения касается биорассасываемой матрицы, состоящей из нативного не реконструированного коллагена I типа, полученной предлагаемым способом.

Полученная предлагаемым способом биорассасываемая матрица имеет упорядоченную структуру коллагеновых волокон, идентичную природной коллагенсодержащей ткани животного, и состоит из нативного не реконструированного коллагена I типа, который постепенно резорбцируется в имплантируемой области, в отличие от применения реконструированной коллагеновой матрицы, в которой ход расположения коллагеновых волокон имеет неупорядоченную структуру.

К положительным свойствам коллагеновой матрицы настоящего изобретения следует отнести ее гибкость и эластичность, дающие возможность создания имплантата требуемой формы, получение быстрого и устойчивого контакта с раной даже при ее нерегулярной поверхности, совместимость и биоинтеграцию с окружающей тканью, отсутствие локальной и системной токсичности, антигенности.

Таким образом, следующий аспект настоящего изобретения, связанный с природой и свойствами полученной биорассасываемой матрицы настоящего изобретения, касается применения ее для заполнения дефектов мягких и твердых тканей.

Еще один аспект настоящего изобретения касается применения биорассасываемой матрицы настоящего изобретения в качестве имплантата в хирургии.

Настоящее изобретение также предлагает способ лечения, репарации или замещения ткани, включающий введение биорассасываемой матрицы, состоящей из нативного не реконструированного коллагена I типа, в твердые и/или мягкие ткани.

Биорассасываемая матрица настоящего изобретения может быть использована в качестве носителя для активных веществ, таких как антибиотики, противовоспалительные средства, витамины, антигеморрагические средства и т.д.

Посредством обычного процесса дегидратации биорассасываемая матрица настоящего изобретения может быть получена в форме порошка, а также может быть использована в форме геля при суспендировании ее в соответствующем жидком носителе. Такие гелевые препараты особенно предпочтительны в глазной хирургии вследствие их светопроницаемости (прозрачности).

Другой предпочтительной областью применения биорассасываемой матрицы настоящего изобретения является хирургическая стоматология, где она используется в качестве регенерирующего средства десен и костей.

Биорассасываемая матрица настоящего изобретения может быть введена в фармацевтические композиции в смеси с подходящими эксципиентами. Такие фармацевтические композиции могут быть получены согласно общепринятым способам, таким, например, как описаны в биорассасываемая коллагеновая матрица, способ ее получения и   применение, патент № 2353397 Remington’s Pharmaceutical Science Handbookбиорассасываемая коллагеновая матрица, способ ее получения и   применение, патент № 2353397 , XVII ed., Mack Pub. Inc., USA. Примерами указанных фармацевтических композиций являются гели, мази, кремы, пеллеты и т.д.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение.

Некоторые операции предлагаемого способа производятся под вытяжным шкафом с горизонтальным ламинарным потоком (класс 100). Дистиллированная вода и применяемые растворы проходят через фильтровальные «цилиндры», которые представляют собой слои PALL из нейлона 66 с микробной задержкой 0,2 микрона и Z-позитивным потенциалом. Посуда и различные материалы стерилизуются в автоклаве или сухой печи (подход биорассасываемая коллагеновая матрица, способ ее получения и   применение, патент № 2353397 over-killбиорассасываемая коллагеновая матрица, способ ее получения и   применение, патент № 2353397 ).

Пример 1

1. Кожу крупного рогатого скота, известного происхождения и с наличием медицинских сертификатов, снимают сразу после убоя. Используя аппараты, которые обычно применяются на дубильных производствах, разделяют аккуратно эпителиальный и жировой слой.

2. Отделанную таким путем кожу разрезают на пластинки размером 20-30 см и вручную с помощью шлифовального станка подвергают последующей очистке для удаления последних следов волосяных луковиц.

3. Полученные пластинки кожи помещают в колбу с круглым дном и взвешивают. В колбу добавляют объем стерильной воды, превышающий в 5 раз вес кусков, и энергично взбалтывают. Воду заменяют и повторяют операцию 5 раз. Манипуляция необходима для удаления большей части волокон и частиц, образовавшихся в течение фаз разреза.

4. Закончив промывание, куски дермы переносят в новую посуду с дистиллированной водой и оставляют в воде при температуре 3-5°С на всю ночь.

5. На следующее утро куски дермы отцеживают на сите № 10 и переносят в новую посуду с закрытой крышкой. Предварительно в турбоэмульсоре готовят необходимый объем водно-щелочного раствора с рН 8,7 (10 литров), содержащего 10% гидроксид натрия, калийдигидрофосфат (500 г) и водный или безводный тетраборнокислый натрий (200 г). Этим раствором заливают куски дермы в резервуаре и взбалтывают на мешалке при температуре 3-5°С. Содержимое резервуара взбалтывают в течение часа, затем заменяют водно-щелочной раствор на новый и вновь помещают резервуар с содержимым взбалтывать на мешалку при температуре 3-5°С на 1 час. В течение дня водно-щелочной раствор меняют каждый час, помещая каждый раз резервуар с содержимым на мешалку и взбалтывая при температуре 3-5°С. Вечером вновь меняют водно-щелочной раствор и резервуар с кусками дермы и водно-щелочным раствором оставляют на всю ночь в состоянии покоя при температуре 3-5°С.

6. На следующее утро производят ручную очистку углов и поверхностей кусков дермы. Эту операцию проводят под вытяжным шкафом. Положив вновь куски дермы в новый резервуар с закрываемой крышкой, добавляют свежий водно-щелочной раствор, после чего резервуар помещают на мешалку при температуре 3-5°С на весь день. Вечером меняют раствор и оставляют резервуар с кусками дермы и раствором на всю ночь при температуре 3-5°С в состоянии покоя.

7. Обработку кусков дермы водно-щелочным раствором продолжают в течение последующих трех дней, раствор меняют утром и вечером. Содержимое резервуара (куски дермы с водно-щелочным раствором) взбалтывают в течение дня на мешалке и выдерживают в состоянии покоя ночью.

8. Утром следующего дня куски дермы обильно промывают под текущей дистиллированной водой на сите. Затем куски дермы помещают в новый резервуар с крышкой, добавляют дистиллированную воду и содержимое резервуара взбалтывают в течение 20 мин. Далее проводят отцеживание на сите № 10, куски дермы кладут в резервуар, в который добавляют водный раствор сульфата натрия и гидроокиси натрия (на 10 литров раствора используют 1 кг сульфата натрия и 500 г гидроокиси натрия). Раствор взбалтывают в течение трех часов, затем обновляют его и резервуар с кусками дермы в свежем растворе выдерживают при температуре 3-5°С в течение ночи в состоянии покоя. Следующим утром раствор вновь обновляют. В течение дня куски дермы, погруженные в раствор, подвергают циклам взбалтывания (30 мин) и покоя (2 часа). Вечером резервуар с содержимым оставляют при температуре 3-5°С.

9. На следующее утро куски дермы отцеживают (сито № 10), обильно промывают дистиллированной водой и переносят в новый закрытый резервуар, в который добавляют водный раствор сульфата натрия (на 10 литров раствора используют 1 кг сульфата натрия). Куски дермы в растворе взбалтывают в течение часа, затем раствор обновляют. Операцию проводят 4 раза. Затем раствор обновляют и взбалтывание проводят еще 2 часа. Раствор вновь обновляют и резервуар с кусками дермы и раствором оставляют при температуре 3-5°С в течение ночи.

10. На следующее утро куски дермы отцеживают (сито № 10), обильно промывают дистиллированной водой и переносят в новый закрытый резервуар, в который добавляют водный раствор борной кислоты (на 10 литров раствора используют 250 г борной кислоты). Раствор взбалтывают в течение часа, затем обновляют. Операцию повторяют два раза через каждые два часа. Раствор вновь обновляют и резервуар с кусками дермы и раствором оставляют при температуре 3-5°С в течение ночи.

11. На следующее утро куски дермы отцеживают, обильно промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод.

12. Куски дермы сушат в сушильном шкафу, доводя их влажность до 65%, упаковывают в полиэтиленовые пакеты и отправляют на стерилизацию потоком быстрых электронов.

13. Стерильный продукт хранится при комнатной температуре до момента использования.

При проведении стадий обработки дермы животного водно-щелочным раствором, содержащим гидроксид натрия, калий дигидрофосфат и водный или безводный тетраборнокислый натрий, при pH 7,5 или 9,5, температуре 1-3°С или 8-10°С получают аналогичный продукт.

Полученная предлагаемым способом биорассасываемая матрица состоит из нативного не реконструированного коллагена I типа с четко сохраненной пространственной структурой, что отчетливо видно при ее электронно-микроскопическом исследовании.

На фиг.1 представлена фотография, сделанная с помощью сканирующего электронного микроскопа, полученной указанным выше способом биорассасываемой коллагеновой матрицы настоящего изобретения с четко ориентированной пространственной структурой.

Таким образом, в отличие от известных способов получения нативного реконструированного коллагена, которые сводятся к разрушению межмолекулярных связей коллагенового волокна, т.е. структуры коллагена, при помощи ферментов (например, пепсина) или кислот (например, уксусной кислоты) с последующей очисткой и скреплением фибрилл при помощи различных дубящих средств (например, глутаровым альдегидом или сахаросодержащим агентом), в предлагаемом способе получения биорассасываемой матрицы исключается применение разрушающих структуру нативного коллагена химических агентов и дубящих средств, что позволяет получить нативную, практически лишенную иммуногенных свойств, не реконструированную коллагеновую матрицу. Получение коллагеновых матриц представлено на фиг.2, где на фиг.2А показан процесс получения реконструированного коллагена, а на фиг.2В — процесс получения нативного не реконструированного коллагена.

Предложенный способ получения биорассасываемой коллагеновой матрицы позволяет сохранить пространственную архитектонику нативного коллагена без разрушения его структуры (это отчетливо видно при электронно-микроскопическом исследовании), что способствует направленному росту соединительной ткани в области имплантации строго по коллагеновой матрице, исключая беспорядочный рост рубцовой ткани в области раны.

На фиг. 3 представлен ход формирования коллагеновых волокон в динамике при имплантации биорассасываемой коллагеновой матрицы настоящего изобретения в область раны, полученный с помощью электронно-микроскопического исследования. Коллагеновые волокна (1) в зоне имплантации полученной биорассасываемой матрицы через три месяца от начала опыта показаны на фиг.3А и через 6 месяцев от начала опыта показаны на фиг.3В. Наблюдается постепенное замещение коллагенового имплантата окружающей соединительной тканью. Как видно на фиг.3 коллагеновые волокна строго параллельны друг другу и не имеют хаотичного расположения.

Биорассасываемая матрица настоящего изобретения имеет структуру коллагеновых волокон, идентичную природной коллагенсодержащей ткани животного, и состоит из нативного не реконструированного коллагена I типа. При использовании предлагаемой биорассасываемой матрицы в качестве имплантата нативный не реконструированный коллаген I типа, из которого она состоит, постепенно резорбцируется в имплантируемой области, замещаясь окружающими матрицу собственными тканями организма. Поскольку матрица не содержит никаких клеток, она не вызывает выраженной реакции организма на себя как на инородное тело. К положительным свойствам описываемой коллагеновой матрицы следует отнести ее гибкость и эластичность, дающие возможность создания быстрого и устойчивого контакта с раной даже при ее нерегулярной поверхности, совместимость и биоинтеграцию с окружающей тканью, отсутствие локальной и системной токсичности, антигенности, а также минимальные требования к хранению и длительный срок годности. Эта нативная матрица, волокна которой напоминают решетку, действует как шаблон для формирования новой ткани. Фибробласты, кровеносные и лимфатические сосуды, нервные волокна из окружающей здоровой ткани, внедряясь в коллагеновую матрицу, распространяются строго по ней. Постепенно рассасываясь, описываемая матрица формирует новый аутодермальный слой. Таким образом, в отличие от применения реконструированной коллагеновой матрицы, в которой ход расположения коллагеновых волокон имеет неупорядоченную структуру, при использовании предложенной матрицы исключается беспорядочный рост рубцовой ткани как ответной реакции организма на скорейшее закрытие поврежденной ткани.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения биорассасываемой матрицы, состоящей из нативного не реконструированного коллагена I типа, включающий следующие стадии:
обработку кожи животного, очищенной от волосяных луковиц и подкожно-жировой клетчатки, водой;
обработку дермы животного водно-щелочным раствором, содержащим гидроксид натрия, калий дигидрофосфат и водный или безводный тетраборнокислый натрий, при температуре от 1 до 10°С;
обработку дермы животного водным раствором сульфата натрия и гидроксида натрия;
обработку дермы животного водным раствором сульфата натрия;
обработку дермы животного водным раствором борной кислоты;
причем обработку дермы животного на третьей, четвертой и пятой стадиях осуществляют при периодическом взбалтывании раствора и периодическом охлаждении до температуры от 1 до 10°С; и после каждой из стадий со второй по пятую осуществляют промывку дермы водой до достижения нейтрального значения рН промывных вод.

2. Способ по п.1, в котором после первой стадии дополнительно выдерживают дерму животного при температуре от 1 до 10°С, предпочтительно от 3 до 5°С.

3. Способ по п.1, в котором вторую стадию осуществляют в течение 5 суток при температуре 3-5°С и замене раствора, по крайней мере, 2 раза в день.

4. Способ по п.1, в котором на второй стадии в течение суток непрерывное взбалтывание раствора осуществляют 12-16 ч и оставляют раствор в состоянии покоя в течение 8-12 ч.

5. Способ по любому из пп.1, 3 или 4, в котором на второй стадии в первые сутки замену раствора осуществляют через каждый час в течение 12-16 ч.

6. Способ по любому из пп.1, 3 или 4, в котором на второй стадии в течение вторых, третьих, четвертых и пятых суток раствор заменяют дважды в сутки.

7. Способ по п.1, в котором вторую стадию осуществляют при значении рН равном 7,5-9,5, предпочтительно — 8,7.

8. Способ по п.1, в котором третью стадию осуществляют в течение двух суток.

9. Способ по п.1, в котором третью стадию осуществляют при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 12-16 ч и при охлаждении до температуры от 1 до 10°С в течение, по крайней мере, 8-12 ч.

10. Способ по любому из пп.1, 8 или 9, в котором третью стадию осуществляют при взбалтывании раствора, по крайней мере, в течение 3 ч при комнатной температуре и сохранении в состоянии покоя, по крайней мере, в течение 8-12 ч при температуре от 1 до 10°С.

11. Способ по любому из пп.1, 8 или 9, в котором третью стадию осуществляют в течение одних суток при взбалтывании раствора в течение 30 мин каждые два часа при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 12-16 ч.

12. Способ по любому из пп.1, 8 или 9, в котором на третьей стадии охлаждение осуществляют до температуры от 3 до 5°С.

13. Способ по любому из пп.1, 8 или 9, в котором на третьей стадии раствор заменяют, по крайней мере, 2 раза в сутки.

14. Способ по п.1, в котором четвертую стадию осуществляют в течение, по крайней мере, одних суток.

15. Способ по п.1, в котором четвертую стадию осуществляют при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 12-16 ч и при охлаждении до температуры от 1 до 10°С в течение, по крайней мере, 8-12 ч.

16. Способ по любому из пп.1, 14 или 15, в котором на четвертой стадии охлаждение осуществляют до температуры 3-5°С.

17. Способ по любому из пп.1, 14 или 15, в котором четвертую стадию осуществляют в течение одних суток при взбалтывании раствора в течение, по крайней мере, одного часа не более четырех раз в течение 12-16 ч.

18. Способ по любому из пп.1, 14 или 15, в котором на четвертой стадии замену раствора в течение одних суток осуществляют не более четырех раз вдень

19. Способ по п.1, в котором пятую стадию осуществляют в течение, по крайней мере, одних суток.

20. Способ по п.1, в котором пятую стадию осуществляют при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 12-16 ч и при охлаждении до температуры от 1 до 10°С в течение, по крайней мере, 8-12 ч.

21. Способ по любому из пп.1, 19 или 20, в котором на пятой стадии охлаждение осуществляют до температуры 3-5°С.

22. Способ по любому из пп.1, 19 или 20, в котором пятую стадию осуществляют при взбалтывании раствора в течение одного часа каждые два часа, но не более двух раз в течение, по крайней мере, 12-16 ч.

23. Способ по п.1, в котором после осуществления пятой стадии раствор выдерживают в состоянии покоя при температуре от 1 до 10°С в течение, по крайней мере, 8-12 ч.

24. Способ по п.1, в котором дополнительно осуществляют сушку полученного продукта до 50-75% влажности.

25. Способ по п.24, в котором сушку продукта осуществляют до 65% влажности.

26. Способ по п.1, в котором дополнительно осуществляют стадию стерилизации полученного продукта.

27. Биорассасываемая матрица, состоящая из нативного не реконструированного коллагена I типа, полученная по способу, охарактеризованному в любом из пп.1-26.

28. Биорассасываемая матрица по п.27 для заполнения дефектов мягких и твердых тканей.

29. Биорассасываемая матрица по п.27 для использования в качестве имплантата.

30. Применение биорассасываемой матрицы по п.27 для заполнения дефектов мягких и твердых тканей.

31. Применение по п.30 биорассасываемой матрицы в качестве имплантата в хирургии.

32. Способ лечения, репарации или замещения ткани, включающий введение биорассасываемой матрицы по п.27 в твердые и/или мягкие ткани.



Источник: www.freepatent.ru


Добавить комментарий