Рск ртга

Рск ртга

Использование иммунологических реакций в диагностике  инфекционных заболеваний. Реакции, что базируются на феноменах агглютинации и преципитации.

Реакции лизиса и связывания комплемента

 

 

 

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНА С

АНТИТЕЛОМ

 

Взаимодействие антигена со специфическим антителом проявляется в организме образованием иммунных комплексов. Свойства комплекса АГ – АТ показано на рисунке 1.

Прочному взаимодействию АГ с АТ способствуют: количество детерминант в АГ, количественное соотношение, последовательность расположения концевых групп аминокислот в детерминанте, наличие в детерминанте ароматических аминокислот, аффинность и авидность (рис. 2).

Аффинитет – это связь одного активного центра: Fab 1 или Fab 2 и детерминанты.

Авидность – это cвязь всех активных цетров: Fab1 и Fab2 с детерминантами

 

 

СХЕМАТИЧЕСКОЕ ИЗОБРАЖЕНИЕ СТЕПЕНИ

АФФИНИТЕТА И АВИДНОСТИ В ЗАВИСИМОСТИ

ОТ СТЕРИЧЕСКОГО СООТВЕТСТВИЯ РЕАГИРУЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ –АГ и АТ

 

Связь одного активного центра: Fab 1 или Fab 2 и детерминанты – аффинитет.

Связь всех активных цетров: Fab1 и Fab2 с детерминантами – авидность.

 

 

 

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АГ И АТ

(детерминанты и активного центра)

 

 

Реакции АТ с АГ протекают также в системе «in vitro» и имеют ряд типичных характеристик: потребность в электролитах, обратимость, двухфазность (фаза взаимодействия активного центра АТ и детерминант АГ – несколько секунд или минут; фаза проявления – визуально наблюдаемый эффект — несколько минут или часов)

 

Часто такие реакции называют серологическими (от латинского «serum» – сыворотка), так как источником АТ служит сыворотка крови.

В связи с высокой чувствительностью и специфичностью серологические реакции нашли широкое диагностическое применение.

Серологические реакции применяют для двух целей:

1. По известному АГ определяют в исследуемой сыворотке титр специфических к данному АГ антител. Титром сыворотки называют то ее максимальное разведение, которое еще дает положительную реакцию с соответствующим АГ.

2. С помощью известного АТ, т.е. диагностической иммунной сыворотки, определяют наличие в исследуемом материале специфического антигена или осуществляют серологическую идентификацию выделенной чистой культуры возбудителя.

Все серологические реакции можно разделить на несколько групп:

1. Реакции, протекающие с укрупнением частиц АГ в растворе электролита: реакция агглютинации в ее различных вариантах, реакция преципитации и ее различные модификации.

2. Реакции, протекающие с участием комплемента: реакция связывания комплемента, иммунного гемолиза и их модификации.

3. Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена: реакции нейтрализации токсинов, вирусов, реакции торможения гемагглютинации.

4. Реакции, протекающие с участием фагоцитоза: опсонофагоцитарная реакция и другие.

5. Реакции иммунофлюоресценции в различных вариантах.

6. Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы: ИФА, РИА.

 

АНТИГЕНЫ

 

 Для серологических реакций могут быть использованы целые клетки (корпускулярные антигены), например, лимфоциты, плазмоциты, клетки, пораженные вирусами, опухолевые клетки и т.д. (РИФ, РИА, ИФА); бактериальные клетки (РА, РИФ, РИА, ИФА); а также растворимые компоненты (растворимые, молекулярные АГ) для реакции преципитации, нейтрализации, ИФА и других.

 Принципы получения корпускулярного антигена:

 Корпускулярный АГ – это живые или убитые (инактивированные) клетки в изотонических или буферных растворах.

 При инактивации клеток пользуются методами, не вызывающими изменения специфичности и снижения иммуногенных свойств.

 Микроорганизмы инактивируют: 1) высокой температурой, подвергая медленному нагреванию во избежание денатурации белков; 2) химическими веществами (формалином, спиртом и другими); 3) ультразвуком, ультрафиолетом и рентгеновскими лучами. Облучением, в частности, инактивируют опухолевые клетки.

 Стандартные антигены из инактивированных патогенных микроорганизмов широко применяются в серологическом анализе при обнаружении антител в сыворотках людей и животных.

 С помощью серологических реакций выявляют у исследуемых бактериальных клеток антигенный состав.

 Взвеси эритроцитов, лимфоцитов, опухолевых клеток в серологических реакциях используют для определения локализованных на их поверхностных мембранах АГ групп крови, СД-маркеров, трансплантационных, опухолеспецифических и других АГ, а также для обнаружения в сыворотках АТ к этим антигенам.

 

Принципы получения растворимых антигенов

 Для изучения природы, функции и иммуногенности отдельных антигенных веществ, входящих в состав клеток или других сложных систем, а также для выявления антител к от-дельным антигенам, необходимо получить антигены в чистом виде. Это многоступенчатый процесс, требующий применения комбинаций различных методов.

 Антигены прокариот и эукариот получают экстрагированием различными растворителями целых или дезинтегрированных клеток.

 Так, из целых микробных клеток обычно экстрагируют вещества, которые нековалентно интегрированы в состав клеточной стенки. Например, белок А золотистого стафилококка и липополисахарид наружной мембраны Гр (-) бактерий.

 Чаще экстракции предшествует дезинтеграция клеток.

 Наиболее часто клетки разрушают: 1) механически в специальных приборах (дезинтеграторах и прессах); 2)клетки можно разрушить, воздействуя на них ультразвуком; 3) при помощи ферментов, которые разрывают ковалентные связи, разрушают отдельные клеточные структуры; 4) при помощи детергентов, которые связывают молекулы белков и липидов.

 Полученную дезинтегрированную клеточную массу разделяют на отдельные клеточные компоненты, применяя различные виды центрифугирования: дифференциальное, зональное, равновесное в градиенте плотности.

 Отдельные антигены из дезинтегрированных или интактных клеток, а также из их изолированных структур экстрагируют дистиллированной водой, буферами, растворами кислот, щелочей и т. д.

 Экстракты – это сложные смеси антигенов и дополнительных балластных вещест

Антигены выделяют и очищают фракционированием различными методами: избирательным осаждением солями тяжелых металлов, гельфильтрацией, аффинной хроматографией с использованием моноклональных антител.

 Высокая степень очистки микробных и тканевых антигенов имеет большое практическое значение, так как повышает чувствительность серологических реакций, следовательно, эффективность диагностики.

 

Принципы получения иммунных сывороток.

Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену.

 В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами.

 В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, — их высокая специфичность и достаточное содержание антител.

 По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические — к одному конкретному антигену.

 Получить моноспецифические сыворотки можно: 1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены, 2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности. Для этого используют:

1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ — АТ и выделением антител;

2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные антитела.

 Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой) принадлежности и авидности, поскольку синтезируются разными клонами лимфоцитов, вовлеченными в иммунный ответ

 Идентичными по всем характеристикам являются антитела к одной антигенной детерминантной группе, продуцируемые клеточным клоном, происходящим из одного лимфоцита, т. е. моноклональные антитела.

 Для иммунизации животных готовят корпускулярные или растворимые антигены различной степени очистки в зависимости от задач исследования.

 Получение сыворотки, отвечающей предъявляемым требованиям, во многом зависит от кратности, сроков и способов введения антигенов.

 Способы введения антигенов животным могут быть различными (внутривенные, подкожные, внутрикожные и другие). Хорошо комбинировать внутривенное и локальное введение антигенов.

 Количество антител в полученной сыворотке устанавливают титрованием ее в соответствующей серологической реакции с гомологичным антиген

 

Все серологичные реакции используются  для:

 

1)  выявления антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов-диагностикумов – для серологической диагностики инфекционной болезни;

2) определения неизвестных антигенов (бактерий, грибов, вирусов) за известными стандартными сыворотками-антителами – для серологической идентификации возбудителей.

Реакция агглютинации

 

1. Реакции агглютинации

Феномен агглютинации заключается в способности АТ (агглютининов) связываться с корпускулярными АГ (агглютиногенами), склеивая их в агрегаты (агглютинаты), которые выпадают в осадок в присутствии электролита.

Механизм реакции агглютинации описывается теорией «решетки», согласно которой агглютинат образуется при соединении одного активного центра 2-х валентного антитела с детерминантной группой АГ, а второго активного центра – с детерминантной группой другого АГ.

 

Описание: Описание: http://im2-tub-ua.yandex.net/i?id=213182487-50-72&n=21

Рис. Схема реакции прямой агглютинации

 

По характеру агглютината различают зернистую и крупно-хлопчатую агглютинацию. Зернистая наблюдается при агглютинации безжгутиковых бактерий, хлопчатая — у жгутиковых бактерий.

Способы постановки реакции агглютинации:

 Существуют различные варианты постановки реакции агглютинации, из которых наиболее распространены пластинчатая и объемная (развернутая) реакции.

Пластинчатую реакцию агглютинации выполняют на стеклянных или фарфоровых пластинках с гладкой и тщательно обезжиренной поверхностью для обеспечения растекания реагентов. Применяют ее как ускоренный ориентировочный метод обнаружения антител, а также для идентификации клеточных антигенов (микробных, эритроцитарных, лейкоцитарных). В зависимости от задач эксперимента в капле сыворотки на стекле агглютинируют известный диагностикум, исследуемые микробные или другие клетки. Этот вариант реакции агглютинации отличается простотой постановки и позволяет быстро анализировать большое количество проб сыворотки или культур микроорганизмов. Положительная реакция прямой агглютинации на стекле имеет диагностическое значение только при использовании адсорбированных сывороток

Описание: Описание: http://nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/microbiology/stu/immun/pict/ra2.gif

 

Описание: Описание: https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQ60mGhVyQlwZ0fIQjdDIheSotchAgP0SNFNRuHL9n-f6jNYm9k

 

Рис. Пластинчатая реакция агглютинации

 

Развернутую реакцию агглютинации проводят в пробирках или в лунках полистероловых пластин с несколькими последовательными разведениями сыворотки, в которые вносят одинаковые количества антигена. Эта реакция дает возможность определить не только количество антител, но и идентифицировать микроорганизмы при использовании неадсорбированных сывороток.

 

 Описание: Описание: http://nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/microbiology/stu/immun/pict/ra4.gif

Рис. Развернутая реакция агглютинация

 

В инфекционной патологии и эпидемиологии РА наиболее применима в следующих направлениях:

а) для выявления АТ у больного, носителя, переболевшего и иммунизированного.  Исследуемую сыворотку титруют в изотоническом (физиологическом) растворе двукратно и последовательно (например, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д.) в пробирках лунках и добавляют корпускулярный антиген, чаще стандартные диагностикумы.

Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий.

 Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37  С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в определенном титре сыворотки, который служит диагностическим. Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туляремии -1:100.

Для выявления антител можно ставить экспрессные реакции агглютинации (время учета несколько минут). Например:

1. Кровяно-капельная реакция при туляремии. В каплю цельной крови больного на специальном стекле наносят каплю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляремийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2 минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков.

2. На стекле проводится экспрессная реакция агглютинации по Хеддельсону при бруцеллезе.

Данные реакции не позволяют определить количество антител в сыворотке.

б) для идентификации чистой культуры возбудителей инфекционных болезней.

 С этой целью используются иммунные диагностические агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтами вакцин и сывороток, путем иммунизации животных целыми микробными клетками.

 Для достоверности сыворотки лучше использовать адсорбированные, чтобы в них содержались только антитела, соответствующие определенному виду или типу микроорганизма.

При идентификации (серотипирования) чистой культуры возбудителя часто ставят ориентировочную пластинчатую реакцию агглютинации. На стекла вносят капли диагностических агглютинирующих сывороток, в которые вносят изучаемую чистую культуру возбудителя. Результат учитывается через несколько минут.

 Если сыворотки неадсорбированные – после ориентировочной ставят развернутую реакцию агглютинации.

 Принадлежность микроорганизма к данному виду или типу устанавливают лишь в том случае, если он агглютинируется соответствующей диагностической сывороткой не менее чем до ½ или ¾ ее титра.

Реакция агглютинации основана на специфическом взаимодействии антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками. В результате такого взаимодействия образуются частицы-агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат). В реакции агглютинации могут участвовать бактерии, простейшие, грибы, дрожжи, риккетсии, эритроциты и другие клетки, как живые, так и убитые. Протекает реакция в две фазы: первая — специфическое соединение антигена и антитела, вторая — кеспецифическая, т. е. образование видимого агглютината. Выпадение агглютината происходит в присутствии электролитов, например хлорида натрия. Находящиеся в агглютинате микроорганизмы остаются живыми, но теряют подвижность.

Реакцию агглютинации широко применяют для серологической диагностики инфекционных заболеваний и определения антигенной структуры выделенных микробов. Для установления антигенной структуры возбудителя, выделенного из организма больного или носителя, используют специфическую иммунную сыворотку, полученную иммунизацией животных (кролика, осла, барана) определенными микроорганизмами. Идентификацию микроба проводят в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными или монорецепторными сыворотками или в пробирках с видовыми агглютинирующими сыворотками. Адсорбированные сыворотки содержат антитела только к специфическим для данного микроба антигенам, а монорецепторные — только к одному специфическому антигену возбудителя. Видовые сыворотки содержат антитела ко всем антигенам определенного микроба.

Принадлежность выделенной культуры микроорганизма к данному виду определяется при агглютинации его известной сывороткой до титра антител, указанного на этикетке ампулы с сывороткой. Титром антител сыворотки считают последнее разведение ее, в котором еще наблюдается агглютинация культуры микробов, использованных для иммунизации животного. Адсорбированные и монорецепторные сыворотки используют обычно в реакции агглютинации на стекле неразведенными.

При.определении наличия антител в сыворотке крови больного ее разводят изотоническим раствором хлорида натрия начиная с разведения 1 : 50 до 1 : 800 или более. В каждое разведение добавляют взвесь живых или убитых микробов. Препараты, содержащие микробы, убитые нагреванием или формалином, называют диагностикумами. Диагностикумы, полученные путем прогревания культур микроорганизмов, содержат только соматические антигены. При использовании только формалина у микробов сохраняются и жгутиковые антигены.

При наличии антител в крови больного происходит склеивание взятого в реакцию диагностикума и образование осадка (агглютината) на две пробирки. В этом случае результаты реакции агглютинации расценивают как положительные. В контрольной пробирке, куда вносят изотонический раствор хлорида натрия и диагностикум, взвесь микробов должна быть гомогенной (отрицательная реакция агглютинации).

Учет результатов реакции агглютинации при некоторых заболеваниях, например лептоспирозе, проводят только микроскопически в темном поле зрения микроскопа (микроагглютинация). Для постановки серологического диагноза заболевания учитывают диагностический заболевание. Обычно он соответствует разведению сыворотки 1 : 100 или 1 : 200.

Антитела в сыворотке крови больного с помощью реакции агглютинации можно выявить при заболевании брюшным тифом и паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта), туляремии и др.

Реакция Кастеллани. При некоторых инфекционных заболеваниях или иммунизации микроорганизмами, имеющими в своем составе групповые антигены, в сыворотке крови, помимо специфических для данного вида антител, появляются еще и групповые. В этом случае родственные виды бактерий будут агглютинироваться полученными сыворотками.

Кастеллани предложил метод адсорбции групповых антител из иммунных сывороток, основанный на удалении их с помощью микроорганизмов родственных видов, которые имеют групповые антигены, но лишены специфических. Культура таких микроорганизмов, добавленная в сыворотку, адсорбирует неспецифические групповые антитела, и после удаления комплекса антиген — антитело с помощью центрифугирования в сыворотке остаются только специфические иммуноглобулины. Сыворотки, обработанные по методу Кастеллани, могут быть использованы в реакции агглютинации как высокоспецифичные.

 

Непрямые (пассивные) реакции агглютинаци Для данной реакции растворимые антигены или антитела адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, бентонит, активированный уголь и другие) или клетки, например, эритроциты (бараньи, О-группы человека).

 Пассивные реакции агглютинации по чувствительности намного превосходят прямую реакцию агглютинации.  Если адсорбентом являются эритроциты, реакция носит название пассивной (непрямой) гемагглютинации – РПГА или (РНГА).

 Выпускаются коммерческие препараты – эритроцитарные диагностикумы (на эритроцитах нагружены известные молекулярные АГ), которые используются в РНГА для обнаружения специфических АТ в исследуемой сыворотке и эритроцитарные диагностикумы антительные (на эритроцитах нагружены Fc фрагментами известные АТ), которые применяются в РНГА для выявления АГ.

 Реакцию обычно проводят с использованием пластмассовых пластин с лунками. Нагруженные (сенсибилизированные) эритроциты склеиваются в присутствии специфического искомого антигена или антитела и выпадают в осадок в виде гемагглютината в форме «зонтика». При отрицательной реакции

сенсибилизированные эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки».

 

Описание: Описание: http://im8-tub-ua.yandex.net/i?id=201627633-44-72&n=21

 

Рис. . Схема реакции пассивной гемагглютинации.

 

Описание: Описание: http://www.isoseroclon.ru/images/production/planshet2.jpg

 

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постановки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микроорганизмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обла­дающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для иденти­фикации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами  разной групповой  специфичности.

Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного.диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.

 

 

Реакция агглютинации латекса (РАЛ)

Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы полистиролового латекса диаметром  0,5-1,2 мкм, которые в присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно быстро – на протяжении 2-7 мин, что позволяет ее применять как экспресс-метод выявления антигенов и антител. Нагруженные антителами частицы латекса широко используются для выявления антигенов вирусов и бактерий.

Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в сыворотке больного. Такую модификацию РАЛ используют для выявления противогриппозных, противокраснушных, протикоревых антител и т.д.

Описание: Описание: Описание: R

Рис. Проведение  реакции латекс-агглютинации

Описание: Описание: http://hastane.deu.edu.tr/merkezlab/dokuman/ismia/web/www.diaglab.vet.cornell.edu/clinpath/modules/coags/images/ddimer.jpg

Учет реакции латекс агглютинации

 

Реакция коагглютинации (КОА)

Для постановки КОА  используют золотистые стафилококки (штамм Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых находится активный центр антитела.

Описание: Описание: http://im7-tub-ua.yandex.net/i?id=38240703-50-72&n=21

 

Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и др.) и стафилококкового диагностикума. Смесь тщательно перемешивают  и через 2-5 мин. на тёмном фоне учитывают результаты.  На тёмном фоне должна четко будет просматриваться мелкозернистая агглютинация стафилококков.

 

Описание: Описание: http://www.healthcare.uiowa.edu/cme/clia/images/testID11/Figure01.jpg

 

2. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ это агрегация антителами (преципитинами) растворимых (молекул) АГ (преципитиногенов), проявляющаяся в помутнении прозрачной жидкости, в появлении преципитата в виде осадка, кольца и т.д.

Таким образом, в отличие от реакции агглютинации, антиген для реакции преципитации обязательно должен быть в молекулярном виде.

 Механизм реакции преципитации аналогичен реакции агглютинации, т.е. по «теории решетки».

 Осаждение из раствора комплексов АГ — АТ происходит в диапазоне эквивалентных соотношений концентраций взаимодействующих молекул. В случае большого избытка одного из реагентов образуется растворимый комплекс АГ-АТ и феномен реакции не проявляется.

 Поскольку преципитиноген имеет ультрамикроскопическое строение и его концентрация в единице объема выше, чем АТ в таком же объеме сыворотки, то для осаждения более легких частичек АГ с образованием видимого преципитата необходимо значительно большее количество АТ. Поэтому диагностические преципитирующие сыворотки выпускают с высоким титром АТ. Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и твердой среде.

 

Реакция преципитации в жидкой среде

 Обязательным условием постановки реакции преципитации (РП) в жидкой среде является максимальная прозрачность иммунореагентов. Реакция происходит при смешивании растворов АГ и АТ или наслоения одного иммунореагента на другой. В этом случае по характеру образовавшего преципитата (в виде кольца) реакция получила название кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется I реакцией-термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).

 

Рис. Механизм  и положительный результат реакции кольцепреципитации

 

Реакция кольцепреципитации.

 

 

Описание: Описание: http://nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/microbiology/stu/immun/pict/rp.gif

 

Реакция преципитации в агаре ( геле )

 Для реакции используют гель, приготовленный из агара Дифко или же специально приготовленный предельно осветленный гель из агар-агара.

Сущность реакции заключается в том, что специфические Ат и АГ диффундируют в гель, взаимодействуя между собой, и образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитата. Радиальная иммунодиффузия в геле может быть простой и двойной.

Рис. 15. Механизм реакций преципитации в агаре.

 

Описание: Описание: http://im0-tub-ua.yandex.net/i?id=123283928-22-72&n=21

Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони.

 В агаре, разлитом тонким слоем в чашки или же на предметное стекло, вырезают лунки на равном расстоянии друг от друга ( 4 – 10 мм ) при помощи специальных штампов или стеклянных трубок с ровными краями.

 В лунки вносят раствор сыворотки или раствор антигена в различных разведениях. Из лунок АГ и АТ диффундируют навстречу друг другу и образуют преципитат в виде тонких белесоватых линий. Поскольку диффузия реагентов из лунок в гель происходит радиально, это позволяет анализировать сразу несколько образцов иммунореагентов, разместив вокруг лунки с антисывороткой несколько лунок с растворами разных антигенов; или наоборот, заполняя периферические лунки антисывороткой, а центральную искомым антигеном; или в центральную лунку внести известный АГ, а в периферические – исследуемую сыворотку в разных разведениях. Метод двойной иммунодиффузии применяют преимущественно для качественного анализа, для определения природы АГ и АТ, но можно использовать и для полуколичественного определения АГ и АТ путем их титрования.

 

Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони.

 Реакцию проводят на пластинках с агаровым гелем. Растворы антигена и антисыворотки помещают в лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. Иммунореагенты диффундируют в геле, при встрече образуют комплексы, которые осаждаются в виде линий преципитации. Этот метод позволяет исследовать сразу несколько образцов иммунореагентов. Например, вокруг лунки с антисывороткой можно разместить несколько лунок с растворами разных антигенов или наоборот.

Метод определения токсигенности микробов в реакции преципитации. Принцип иммунодиффузии в геле положен в основу метода, который применяется для изучения токсигенности (способности вырабатывать токсин) бактерий. Например, для обнаружения дифтерийного токсина на чашку Петри с агаром посередине накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической сывороткой. Рядом засевают исследуемые культуры бактерий. Если они выделяют токсин, то при взаимодействии с антитоксинами между колониями и полоской бумаги образуются линии преципитации.

Описание: Описание: https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRCw0f1pwTrqpDTwJTGkKGgAFwuaZ9itZk7oBmCeW9Ue5pIke02BQ

 

 

Методика определения количества иммуноглобулинов

в сыворотке крови (реакция Манчини)

Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена. В зависимости от специфичности заключенных в геле антител в ходе иммунодиффузии возникает одна или несколько полос преципитации, длина «пробега» которых от «линии старта» пропорциональна концентрации антигена. К усовершенствованным вариантам относятся: двойная радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони) и простая радиальная иммунодиффузия (по Манчини). Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент, во втором — оба. Основная функция геля — локализация преципитата, основана на том, что растворимые антигены и антитела легко диффундируют в геле, а образующиеся иммунные комплек­сы ввиду их большей величины задерживаются внутри ячеек геля, образуют линии и полосы преципитации. Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной диффузии, можно проводить количественное определение антигенов. Взаимное расположение линий преципитации в тестах двойной и встречной иммунодиффузии позволяет оценивать иммунохимическое сходство или различие антигенных компонентов. Методы иммунодиффузии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью.

 

Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстрак­ты различных органов и т. д.

Описание: Описание: http://nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/microbiology/stu/immun/pict/rp1.gif

 

Практическое применение реакции преципитации.

РП применяются:

— для изучения АГ структуры бактерий, сложных белков, жидкостей человека и  животных;

— для изучения токсигенности бактерий;

— при диагностике ряда инфекционных заболеваний бактериальной, вирусной, грибковой природы (сибирской язвы, чумы, туляремии и т.д.);

 В качестве АГ используют раневые экссудаты, фильтраты экстрактов пораженных органов, спинно-мозговую жидкость и т.д.

— для установления степени родства видов микроорганизмов, растений, животных –  определяют общий АГ;

— в судебно-медицинской практике – для определения видовой принадлежности  белков (крови, слюны, спермы и т.д.);

— для выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях.

 

 

Иммуноэлектрофорез является сочетанием двух методов – электрофореза в геле и следующей после него двойной иммунодифузии.

Для проведения реакции иммуноелектрофорезу используют стеклянные пластинки, предметные стёклышки, на которые наносят тонкий слой агара или агарози. Сначала антигены размещают в центре пластинки и разделяют их в электрическом поле. Потом в канавку, сделанную в агаре параллельно к линии раздела антигенов, вносят специфическую сыворотку. Диффундируя друг навстречу другу, антигены и антитела в месте контакта образуют дуги преципитации.

Описание: Описание: http://nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/microbiology/stu/immun/pict/rp3.gif

 

Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат . fecus — хлопья шерсти) — появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин — антитоксин или анатоксин — антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

ФЛОККУЛЯЦИЯ – вид иммунопреципитации, при котором преципитат представляет собой хлопьевидную массу. Реакцию проводят смешиванием разных разведений сыворотки со стандартным количеством раствора АГ в объеме 2 мл.

Первая пробирка, где появились хлопья ( инициальная флоккуляция ) указывает на эквивалентное соотношение АГ и АТ. По инициальной флоккуляции рассчитывают количество сыворотки или АГ, исходя из активности взятых в опыт стандартных препаратов.

 

Описание: Описание: http://nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/microbiology/stu/immun/pict/rp4.gif

 

 

Реакции лизиса и связывания комплемента.

 

Для реакции лизиса необходимые антиген, антитело и комплемент. Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или другие клетки. Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку или сыворотку больного. В зависимости от того, против каких клеток направленное действие лизины, они имеют свои названия: против бактерий — бактериолизины, спирохет — спирохетолизины, эритроцитов — гемолизины, против других клеток — цитолизины. Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) — антитело, связывается с ним, активируется за классическим путем и вызывает растворение клетки. Без комплемента лизис клетки невозможен.

Специфические АТ, обуславливающие лизис (растворение) клеток, носят название лизинов. Эти АТ применительно к бактериям называются бактериолизинами, к эритроцитам — гемолизинами.

Лизины способны проявить свое лизирующее действие на АГ только в присутствии комплемента, который является составной частью любой свежей сыворотки.

Таким образом, в основе реакции лизиса лежит взаимодействие трех компонентов:

1) корпускулярного АГ (бактериальных клеток, эритроцитов и др. клеток);

2) специфических АТ иммунной сыворотки (бактериолизинов, гемолизинов и др.);

3) комплемента (сыворотка морской свинки).

В начале реакция идет по типу агглютинации, затем к комплексу АГ-АТ присоединяется комплемент. Наступает активация компонентов комплемента, которая приводит к лизису клеток (АГ).

В микробиологической диагностике реакция бактериолиза применяется для:

1) определения вида неизвестного микроба при помощи специфической сыворотки;

2) определения в исследуемой сыворотке наличия бактериолизинов к известному микробу.

Исследуемую сыворотку, для разрушения имеющегося в ней комплемента, инактивируют при 56 °С в течение 30 минут.

Под воздействием бактериолизинов в присутствии комплемента микробы теряют подвижность, меняют форму (набухают), распадаются и, наконец, совсем растворяются.

Реакция бактериолизина применяется при холере с целью идентификации вибрионов (р. иммобилизации вибрионов холерными сыворотками) и определения вибриолизинов в сыворотке; при сифилисе (р. иммобилизации трепонем), при лептоспирозе (р. агглютинации-лизиса); при возвратном тифе с целью серодиагностики (р. лизиса).

Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с АТ-ми в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко красную прозрачную жидкость — «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. Реакция гемолиза используется как индикаторное при постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК), для титрования комплемента и гемолитической сыворотки.

 

 

Описание: Описание: http://meduniver.com/Medical/Xirurgia/Img/1229.jpg

Реакция гемолиза       

 

Постановка и учет РСК

 

Перед постановкой реакции готовят рабочие растворы реагентов РСК.

Антитела (Ig M, Ig G), участвующие в РСК, характеризуются способностью связывать комплемент. Исследуемую сыворотку накануне постановки реакции прогревают на водяной бане при температуре 56

 С в течение 30 мин для инактивации собственного комплемента. В день постановки реакции сыворотку разводят раствором хлорида натрия (0, 15 моль/л) в соотношении 1 : 5 (для качественного анализа) или же готовят ряд последовательных, кратных двум разведений – от 1 : 5 до 1 : 640 (для определения титра АТ).

Антигены, используемые в РСК, могут быть корпускулярными или растворимыми: взвеси бактериальных клеток, их лизаты. Белковые или полисахаридные вещества, экстракты из нормальных и патологически изменённых тканей.

Комплементом является смесь сывороток морских свинок – свежая или лиофилизированная (сухой комплемент – препарат промышленного изготовления), которую разводят раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10 непосредственно перед употреблением, так как при хранении в жидком состоянии её активность снижается.

Гемолитическую сыворотку с известным титром АТ (1 : 1200, 1 : 1600, 1 : 1800) изготовляют промышленным путём, иммунизируя кроликов эритроцитами барана.

Эритроциты получают из дефибринированной крови барана. Кровь фильтруют через трёхслойный марлевый фильтр для удаления плёнок фибрина, затем фильтрат центрифугируют (2000 мин

-1) в течение 10 мин. Удаляют плазму, а эритроциты наоборот остаются.

Поэтому антигены перед проведением опыта титруют в присутствии рабочей дозы комплемента.

а) антиген разводят в объёмах 0,5 мл;

б) добавляют в каждую пробирку 0, 5 мл рабочей дозы комплемента;

в) помещают в термостат при температуре 37  С на 1 час;

г) добавляют во все пробирки по 1, 0 мл гемолитической системы;

д) помещают в термостат при температуре 37 С на 1 час;

 

Опытная система АНТИГЕН (Бактерия,  клетка,  вирус и т.д.)

АНТИТЕЛО (сыворотка)  

 

КОМПЛЕМЕНТ

 

Комплемент связался  с комплексом антиген-антитело

Индикаторная  гемолитическая система

 

ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНА  (АНТИГЕН)

ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО)

 

Комплемента нет — связался с опытной системой.  Без  комплемента  гемолиз эритроцитов       невозможен.

Описание: Описание: http://userdocs.ru/pars_docs/refs/27/26076/26076_html_m1ba61340.jpg

 

 

Описание: Описание: http://www.domotvetov.ru/images_bin/article/Image/1-199-2-1.jpg

Описание: Описание: Описание: immun40

Рис. РСК

Учет реакции связывания комплемента

(++++) – реакция резко положительная (полная задержка гемолиза, жидкость бесцветная, все эритроциты на дне),

(+++, ++) – реакция положительная (слабо окрашенная жидкость, осадок эритроцитов на дне пробирки),

(+) – слабо положительная реакция (жидкость интенсивно окрашена, на дне незначительное количество эритроцитов),

(−) – отрицательная реакция (наблюдается полный гемолиз).

 

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ

 

Эту реакцию используют при вирусных заболеваниях как для определения антител в крови больного, так и для идентификации вирусов, выделенных у больных . Принцип реакции нейтрализации заключается в том, что специфические иммунные сыворотки способны гасить инфекционное действие вируса при смешивании вирус содержащего материала и соответствующих вирусу иммунных сывороток. Эффект нейтрализации вируса антителами определяют, вводя смесь чувствительному животному, после выдерживания ее в течение определенного времени. Постановку реакции нейтрализации осуществляют в двух модификациях: 

1) титруют (разводят) взвесь или исследуемый материал и соединяют эти разведения с определенной постоянной дозой иммунной сыворотки;

2) постоянную определенную дозу вируса соединяют с различными дозами иммунной сыворотки — титруют сыворотку.

О результатах реакции нейтрализации судят по гибели чувствительных животных, зараженных смесью вирус содержащего материала и сыворотки, или по клинической картине заболевания. В культуре клеток определяют цитопатический эффект — гибель клеток. В случае выделения вируса у больного и при необходимости идентификации его применяют известную иммунную вирус нейтрализующую сыворотку.

Реакцию нейтрализации можно также использовать при установлении типа ботулинического токсина, применяя токсиннейтрализующие специфические иммунные сыворотки, и для определения токсина возбудителя газовой гангрены.

В сыворотке крови иммунизированных людей или перенесших вирусное заболевание обнаруживают антитела, способные нейтрализовать инфекционность вирусов. Эти антитела обычно выявляются при смешивании иммунной сыворотки с соответствующим вирусом с последующим введением этой смеси восприимчивым лабораторным животным или заражением культуры клеток. На основании выживания животного в первом случае или отсутствия цитопатического действия вируса во втором су­дят о нейтрализующей активности сыворотки. Реакция широко применяется в вирусологии для определения вида (типа) возбудителя и титра вируснейтрализующих антител.

 

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфическими антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. РТГА широко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (антигенам).

Реакция торможения гемагглютинации является особой формой реакции нейтрализации, которая проводится в условиях in vitro. Большинство вирусов, особенно миксовирусы, например возбудители болезни Ньюкасла и парагриппа крупного рогатого скота, а также несколько других организмов, а именно Mycoplasma gallisepticum, способны агглютинировать эритроциты одного или нескольких видов животных. Эту реакцию можно затормозить специфическими антителами к вирусу; следовательно, ее можно считать реакцией как на антитела, так и на вирус. На первой стадии реакции при определении антител титруется суспензия вируса, например вируса болезни Ньюкасла, культивируемого на курином эмбрионе, чтобы рассчитать количество агглютинирующего вируса. Для этого готовят двукратные разведения вирусной суспензии и к кажому разведению суспензии добавляют равный объем 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов в физиологическом растворе. Через 30 минут при комнатной температуре эритроциты оседают на дно лунки (эту реакцию обычно проводят на пластиковых досках, создавая картину, аналогичную той, которая описана для реакции с сенсибилизированными эритроцитами. При титровании вирусов в качестве конечной точки выбирается та лунка, в которой произошла полная агглютинация эритроцитов, а не какая-либо промежуточная точка. Разведение вируса в этой точке будет составлять 1 гемагглютинирующую единицу вируса, которой как раз достаточно для агглютинации всех добавленных красных кровяных клеток.

   Для реакции торможения гемагглютинации готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки и в каждую лунку вносят рассчитанный объем разведенной вирусной суспензии, содержащей 4 (а иногда только 2) гемагглютинирующие единицы вируса. После этого в каждую лунку добавляют 1%-ную суспензию эритроцитов и материал инкубируют в течение 30 минут. Агглютинация клеток в лунках с высоким разведением свидетельствует о том, что содержащиеся в сыворотке данного разведения антитела не могут нейтрализовать агглютинирующей активности вируса. И, наоборот, при низких разведениях сыворотки эритроциты образуют плотный осадок на дне лунки; конечную точку титрования выбирают между этими крайними значениями. Следует заметить, что перед проведением реакции торможения гемагглютинации сыворотку нужно обработать для удаления неспецифических ингибиторов вирусной гемагглютинации. Эти ингибиторы, по-видимому, относятся к мукопротеинам и разрушаются после обработки сыворотки фильтратом культуры Vibrio choleras или метаперйодатом калия.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) используется для идентификации вируса болезни Ньюкасла, большинства подтипов вируса гриппа и для титрования антител к ним. Недавно предложен модифицированный вариант этого метода для титрования антител к вирусу чумы крупного рогатого скота. Согласно этой модификации, для агглютинации эритроцитов обезьяны используется вирус, родственный вирусу кори человека. 

 

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ
ИЛИ АНТИТЕЛ

В настоящее время широкое применение получили серологические реакции, в которых участвуют меченые антигены или антитела. К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы. По своей чувстви­тельности они превосходят все описанные выше серологические реакции.

РЕАКЦИИ С МЕТКАМИ

 Образовавшиеся иммунные комплексы можно выявить по метке иммунореагента (АТ или АГ).

 В качестве метки используют:

1. Флюорохромы, способные флюоресцировать в ультрафиолетовых лучах (реакции иммунофлюоресценции — РИФ).

2. Ферменты, при взаимодействии с субстратом обусловливают его распад, который можно выявить по изменению цвета или с помощью специальных приборов (реакции иммуноферментного анализа – ИФА).

3. Радиоактивные метки (реакции радиоиммунного анализа – РИА).

4. Ферритин – белок, содержащий до 28% Fe, хорошо видимый при электронной микроскопии (реакции иммунноэлектронной микроскопии – РИЭМ или ИЭМ).

Требования, предъявляемые к меткам:

1. Они не должны менять специфичность иммунореагента.

2. Они не должны снижать аффинитет и авидность АТ.

3. При присоединении не должны терять своей активности.

4. Должны легко выявляться.

5. Должны быть нейтральными для окружающих людей и среды.

 Серологические реакции с метками высокочувствительны, позволяют быстро получить результат и находят широкое применение для экспресс−диагностики вирусных, бактериальных и других инфекций, для оценки иммунного статуса человека, в онкологии и т.д.

 

Реакции иммунофлюоресценции

 

 Иммунофлюоресценция – это метод, основанный на использовании специфичности иммунологической реакции и чувствительности флюоресцентной микроскопии. Он может быть как прямым, так и непрямым.

 Один из компонентов иммунной реакции, как правило АТ, метится (конъюгируется) флюоресцирующим красителем. Чаще всего для этого используют флюоресцеинизотиоционаты (ФИТЦ) – зеленое свечение в ультрафиолетовом свете и тетраметилродаминизотионат (ТРИТЦ) – оранжево-красное свечение.

 АТ, которые метят флюорохромом, должны обладать фи-зико-химической гомогенностью. Наиболее подходящими для мечения являются моноклональные антитела.

 АГ (искомым или известным) для РИФ могут быть антигены, локализованные в клетке или на клетке, срезах тканей.  РИФ выявляют и идентифицируют:

1) микроорганизмы в чистых и смешанных культурах, в мазках- отпечатках; 2) клетки, пораженные вирусами и другими микроорганизмами;

3) Т и В лимфоциты, нормальные киллеры и другие клетки иммунной системы

РИФ используют: 1) для изучения биосинтеза иммуноглобулинов в плазмоцитах, их транспорта из клеток, иммуноглобулиновых рецепторов В лимфоцитов; 2) для выявления титра антител при серодиагностике; 3) для выяснения закономерностей возникновения и развития злокачественных новообразований на клеточном и тканевом уровне и т.д.

Для постановки РИФ клетки с искомыми (или известными АГ) помещают на

 стекло и фиксируют (чаще всего в ацетоне 10 минут при комнатной температуре),  высушивают в течение 20 минут при 37 0 С, а затем обрабатывают в зависимости от  применяемого варианта РИФ.

 После каждого этапа обязательна 2-х – 3-х кратная промывка буферным раствором  для удаления не вступившего в реакцию иммунореагента.

 

 

Варианты постановки РИФ:

1 Прямая РИФ (была предложена А. Кунсом в 1941 г.).

 Для каждого изучаемого АГ должна быть гомологичная иммунофлюоресцентная  сыворотка.

 

 2. Непрямая РИФ (РНИФ) основана на использовании двух различных

 антисывороток.

 Вначале применяют немеченые АТ к искомому АГ (или искомые АТ в  сыворотке человека к известному АГ).

На 2-м этапе образовавшийся комплекс АГ-АТ обрабатывают антилюминесцентной сывороткой, содержащей меченые флюорохромом АТ к иммуноглобулинам того вида животных, чья сыворотка использовалась на 1 этапе реакции.

 

3. Антикомплементарный метод РИФ (РИФСК) основан на способности

 комплемента (сыворотки морских свинок) фиксироваться на иммунном

 комплексе. В этом варианте используют люминесцентные сыворотки против  глобулинов (комплемента) морской свинки.

 4. РГИФ (реакция гашения иммунофлюоресценции).

 Используется для выявления титра АТ в исследуемой сыворотке, при наличии  известного клеточного АГ и специфической к нему люминесцентной сыворотки.

 На первом этапе на известный АГ наносят исследуемую сыворотку, и если в ней  есть соответствующие антигену антитела, они занимают эпитопы АГ. При

 добавлении на втором этапе люминесцентной сыворотки к данным АГ,

 присоединение люминесцентных АТ к эпитопам происходить не будет.

Свечения не наблюдается.

 Описание: Описание: http://rockland-inc.com/uploadedImages/Support/Protocols/microscopy-2.png

Радиоиммунологический анализ (РИА)

Характерной чертой радиоиммунологического анализа (РИА) является сочетание специфичности, свойственной иммунологичес­ким реакциям, с простотой и высокой чувствительностью оп­ределения. По сравнению с обычными иммунологическими ме­тодами преимущество РИА состоит в том, что отсутствует необ­ходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным про­явлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритро­цитов.

В одном из вариантов РИА меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания со спе­цифическими антителами. Для того чтобы происходило конку­рентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а затем со стандартным меченым антигеном количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена будет обратно пропорционально количеству немеченого антигена в исследуе­мой пробе.

 

Твердофазный радиоиммунологический анализ. Многие поли­меры (полиэтилен, полипропилен, полистирол) обладают спо­собностью связывать антитела или антигены белковой природы. Связанный с твердой фазой комплекс антиген — антитело легко отделяется от несвязавшегося биологического материала и при этом обладает высокой стабильностью. Меченый антиген, необ­ратимо связываясь с фиксированными на матрице антителами, позволяет проводить высокочувствительный анализ биологичес­кого материла.

Методы с использованием твердой фазы (пластмасса, целлю­лоза, сефадекс) существенно упростили процесс и возможность автоматизации процедур.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

 

Особенностью метода ИФА является использование функционально активной биологической молекулы фермента.

Комплекс конъюгированных иммунореагентов с ферментами ( ф ) проявляет функциональную активность, т. е. сохраняется высокая специфичность иммунореагентов и способность фермента расщеплять добавленный субстрат ( с ) с образованием легко обнаруживаемых продуктов. В связи с этим можно регистрировать и учитывать количественно взаимодействие иммунореагента, например АТ с гомологичным АГ.

 Вначале ИФА использовали в иммуногистохимии для выявления локализации тканевых и клеточных АГ, а затем были разработаны варианты реакции, которыми можно качественно и количественно выявить иммунореагенты в жидкостях.

Описание: Описание: http://www.vector-best.ru/publ/doc/9607/Image2.gif

 

 

 

Реагенты реакции:

1. Ферменты применяют только те, которые расщепляют субстрат с образованием продуктов легко (улавливаемых) определяемых: ПХ (пероксидаза хрена), ЩФ (щелочная фосфатаза), каталаза, уреаза, фосфолипаза и др.

 Ферменты, используемые в ИФА должны отвечать следующим требованиям: содержать в структуре определенные реакционные группы, по которым идет связывание с молекулой иммунореагента не меняя его специфичности; быть чис тыми; сохранять ферментативную активность в конъюгированном с иммунореагентом виде.

 Субстратами в зависимости от реагента используют: 5-аминосалициловую кислоту, ортофенилендиамин, пирогаллол и другие.

 2. Иммунореагенты.

 В настоящее время иммунореагентами, с которыми связывают ферменты, могут быть АТ, АГ.

 Фермент присоединяют к иммунореагенту с помощью бифункциональных реагентов: глутарового альдегида, периодат натрия, фенилендималеимида и др. Эти соединения обладают химически активными группировками, которыми  они ковалентно взаимодействуют с биомолекулами. Так, глутаровый альдегид реагирует преимущественно с E аминогруппами аминокислот, в частности лизина, периодат натрия с углеводными остатками.

 

 

3. Классификация и варианты ИФА

 

Существует множество вариантов ИФА.

Прежде всего ИФА включает две группы способов постановки реакции: твердофазный (гетерогенный) – ТИФА и гомогенный — ГИФА. Они в свою очередь подразделяются на различные модификации.

Описание: Описание: http://works.doklad.ru/images/Fam4rLXIoow/m7ffdfb56.png

 

3.1. Гетерогенный (твердофазный) способ — твердофазный ммуноферментный анализ (ТИФА).

 

Твердофазный способ постановки получил самое широкое применение. При этом способе АГ или АТ предварительно дсорбируют на твердый носитель (сорбционно и ковалентно). В качестве твердой фазы используют различные

микропористые (сефароза, стекло, биогель) и непористые носители (полистирол, полихлорвинил, нейлон, полистирен и другие). По физическому состоянию это могут быть гели, шарики, диски, титрационные панели.

 

Описание: Описание: http://works.doklad.ru/images/Fam4rLXIoow/24d715fb.png

 

Чаще всего для ИФА используют полистироловые, поливиниловые пластинки с лунками, которые позволяют адсорбционно связывать АТ и АГ различной природы – белки, ЛПС, гликопротеиды и т.д. Связывание происходит путем адсорбции (т.е. нековалентно) за счет гидрофобных или ионных сил, или конъюгацией (ковалентно). Для получения иммуносорбентов путем ковалентной связи ис пользуют в основном такие сшивающие реагенты, как

бромциан, глутаральдегид, изоцианаты, при этом в качестве твердой фазы применяют целлюлозу, биогель, сефадекс, агарозу и др.

Методы ТИФА применимы и при работе с корпускулярным АГ, например, клетками бактерий и эукариот. Клетки бактерий можно прикрепить к панели высушиванием и усилить прикрепление фиксатором.

 Например, перед адсорбцией клеток бактерий панели обрабатывают поли-L- лизином  в течение 1 часа, лунки промывают и вносят бактериальную взвесь (100мкл взвеси  5х103 — 5х104 в мл ), инкубируют 45 минут и фиксируют

глутаровым альдегидом в  течение 3-5 минут. После связывания иммунореагента свободные места носителя  блокируют, чтобы предотвратить неспецифическое связывание с ним  иммунореагентов на следующих этапах. Для этого применяют различные белки и  реагенты: БСА (бычий сухой альбумин), нормальные сыворотки, твин-20, желатин.

3.2. Варианты ТИФА.

 Существуют неконкурентные и конкурентные варианты.

 При неконкурентных вариантах реакция АГ-АТ происходит на поверхности твердой  фазы, ингредиенты добавляются последовательно и определяется количество метки, связавшейся с носителем При этом количество связавшейся метки прямо пропорционально количеству  искомого АТ или АГ в исследуемом образце.

 При конкурентных вариантах постановки реакции немеченый исследуемый образец и известное количество меченого искомого вносят в лунки, сенсибилизируют АГ  или АТ одновременно, где происходит конкуренция между первым и вторым образцами за связывание с твердофазным иммуносорбентом. В этом случае количество связанной с твердой фазой метки обратно пропорционально количеству  искомого образца.

 

 Результаты ИФА регистрируют с помощью спектрофотометров, измеряя оптическую плотность в опытных и контрольных лунках.

При визуальном учете реакцию расценивают как положительную, если в лунках наблюдается достаточно интенсивное окрашивание, значительно превосходящее окрашивание в лунках с отрицательными контролями.

 ИФА обладает следующими преимуществами:

 высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

— возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

— стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);

— простотой проведения реакции;

— наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета.

 

Описание: Описание: http://www.nerbe-plus.de/typo3temp/pics/f212745756.jpg

 

 

 

ПРИМЕНЕНИЕ ИФА.

 Методы ИФА широко используются в различных областях биологии и медицины.

Иммуноблотинг ( ИБ)

 В основе этого метода лежит использование нитроцеллюлозных полосок, на которые методами горизонтального и затем вертикального электрофореза переносятся АГ в порядке нарастания их молекулярных масс.

 При проведении исследования эти полоски, помещенные в индивидуальные пластиковые кюветы, последовательно взаимодействуют с сывороткой (иммунной или испытуемой), конъюгатом и субстратом в условиях горизонтального встряхивания с целью перемешивания и равномерного взаимодействия реагентов с полоской по всей ее длине.

 После завершения контакта с очередным ингредиентом полоску промывают специальным раствором для удаления несвязавшихся компонентов.

 

При наличии специфичности искомых АГ (АТ) известным АТ (АГ) они связываются в иммунные комплексы в определенных зонах полоски. К этому комплексу присоединяются конъюгат, представляющий собой антивидовые антитела, меченые пероксидазой или другим ферментом. После контакта с субстратом, в местах связывания образуется окрашенный продукт, по локализации и интенсивности окрашивания которого делают визуальное заключение о реакции.

 

Описание: Описание: http://rudocs.exdat.com/pars_docs/tw_refs/281/280010/280010_html_685b1ea5.png

Рис. Пример иммуноблотинга

 

Радиоиммунологический анализ (РИА) – это методики, в которых наличие ИК определяется с помощью радиоактивной метки, предварительно введенной в состав антител или антигенов.

 Наиболее широко используют две разновидности РИА: радиоиммунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоиммунологический анализ (ТФ РИА). В качестве радиоактивной метки используюи три типа изотопов – 3Н, 14С, 125 I (или 131 I ). Наиболее популярный способ получения коъюгатов – метка радиоактивным иодом, т.к. этот метод введения метки практически не снижает иммунологической активности антигенов и антител в процессе формирования ИК.

Чаще всего в РИА используется Y-изотоп – 125I, имеющий более длительное (60 дней) время полураспада, чем радионуклеоид 131 I (8 дней).

 Методика РИП заключается в 1) формировании в растворе радиоактивного иммунного комплекса (при предварительном введении в состав одного из участников реакции антиген-антитело радиоактивной метки), 2) отделении этого комплекса от не вошедших в него макромолекул, 3) анализе его

радиоактивного компонента.

 

 Отделение ИК от макромолекул проводится с помощью различных физико-химических методик: электрофореза в геле, агарозе, адсорбцией на различных органических и неорганических поверхностях и т.д., но наиболее часто для отделения ИК используется метод «двойных антител», в котором ком плекс антиген-антитело утяжеляется с помощью его взаимодействия с антивидовыми иммуноглобулинами, специфичными к антителам, вошедшим в ИК. После формирования вторичного ИК высокомолекулярный преципитат отделяют фильтрацией или центрифугированием. . Далее проводят количественный и качественный анализ радиоактивного компонента преципитата. РИП можно проводить либо в прямом, либо в конкурентном варианте-

 

ОСНОВЫ МЕТОДА ПЦР.

 

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);

2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей).

Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний.

Описание: Описание: http://elementy.ru/images/eltpub/kary-mullis_02_867.jpg

Описание: Описание: http://www.biocontrol.ru/wp-content/uploads/2012/11/%D0%90%D0%BC%D0%BF%D0%BB%D0%B8%D1%84%D0%B8%D0%BA%D0%B0%D1%82%D0%BE%D1%80-ICycler-IQ-5-.jpg

 

Амплификатор ICycler IQ-5 (BioRad, США) – прибор с системой детекции флуоресцентного сигнала в  режиме «реального времени»

 

1. Прямое определение наличия возбудителей.

 Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

2. Высокая специфичность

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК.

3. Высокая чувствительность.

 Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.

 Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма.

5. Высокая скорость получения результата анализа.

 Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 часа.

 

6. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.

 Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

 

 Применение ПЦР в практическом здравоохранении.

 Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение

этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов. Используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина.

 

Показания к применению метода ПЦР при различных заболеваниях.

 1.Применение ПЦР в урогинекологической практике.

 2. Применение в неопатологии.

 3. Применение ПЦР в практике службы крови.

 4. Применение ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии.

 5. Применение ПЦР в клинике инфекционных заболеваний.

 6. Применение ПЦР в иммунологии.

 7.Применение ПЦР в онкологии и др.

 

 

 



Источник: intranet.tdmu.edu.ua


Добавить комментарий